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DNA（液體膠體金試紙條型）恒溫快速擴(kuò)增試劑盒

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更新時間：2025-01-06 21:26:53瀏覽次數(shù)：33次

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北京立博泰業(yè)科技有限公司

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產(chǎn)品簡介

（貨號：WLN5002）原理概述：本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板

詳細(xì)介紹

（貨號：WLN5002）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對最終結(jié)果進(jìn)行檢測。

引物設(shè)計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)（常用）。引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

探針設(shè)計：

探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有三個修飾位點：5’端修飾一個抗原標(biāo)記（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

100T/盒

組成	含量
C buffer	1 mL×2管
L buffer	500 μL×1管
P-core	1.2 mL×1管
N-core	60 μL×1管
B buffer	300 μL×1管
使用說明書	1份

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：6個月

操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。

1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；

3) 向反應(yīng)管中加入12 μL P-core和0.6 μLN-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板；

5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動反應(yīng)管8-10次進(jìn)行混勻；對于多個反應(yīng)，建議提前將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，蓋上蓋后上下顛倒后混勻）；混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中39 oC孵育8-12 min。

6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 min內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。

體系配制

組分	體積（μL）
C buffer	20 5
L buffer	20 5
P-core	12
N-core	0.6
dNTPs(10 mM)	1.5
上游引物(10 μM)	2
下游引物(10 μM)	2
探針(10 μM)	0.6
核酸模板	3.8
B buffer	2.5
總體積	50